1.    Kontaminasi
Kontaminasi merupakan permasalahan mendasar yang sering terjadi pada kultur in vitro. Pada kondisi media yang mengandung sukrosa dan hara, serta kelembaban dan suhu yang relatif tinggi, memungkinkan mikroorganisme serta spora jamur tumbuh dan berkembang dengan pesat. Kontaminasi pada kultur in vitro dapat berasal dari:
·      Udara
·      Eksplan, baik secara eksternal maupun internal.
·      Organisme kecil yang masuk ke dalam media, seperti semut.
·      Botol kultur serta alat-alat yang kurang steril.
·      Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor.
·      Kecerobohan dalam bekerja.

Setiap eksplan memiliki tingkat kontaminasi permukaan yang berbedan tergantung dari :
·      Jenis tumbuhannya
·      Bagian tumbuhan yang dipergunakan
·      Morfologi permukaan (misalnya berbulu atau tidak)
·      Lingkungan tumbuhnya (Green house atau lapang)
·      Musim waktu pengambilan (musim penghujan atau musim kemarau)
·      Umur tumbuhan (seedling atau tumbuhan dewasa)
·      Kondisi tumbuhannya (sehat atau sakit)

Mikroorganisme penyebab kontaminasi dapat berupa bakteri, fungi, protozoa, serangga, virus dan lain-lain. Kontaminasi oleh fungi ditandai dengan munculnya benang-benang halus yang berwarna putih, yang merupakan miselium fungi. fungi dapat menginfeksi jaringan secara sistemik sehingga lama kelamaan dapat menyebabkan jaringan eksplan akan mati. Selain itu, kontaminasi oleh bakteri ditandai munculnya bercak-bercak berlendir pada media atau eksplan. Bercak tersebut biasanya berwarna putih yang merupakan koloni bakteri. Bakteri lebih sulit untuk dideteksi dibandingkan dengan fungi karena dapat masuk ke dalam ruang antar sel.

Ada dua istilah dalam permasalahan kontaminasi, yaitu kontaminasi eksternal dan kontaminasi internal.
a.    Kontaminasi eksternal atau kontaminasi permukaan biasanya disebabkan oleh mikroorganisme yang berasal dari luar eksplan. Respon kontaminasi eksternal ini sangat cepat karena mikroorganismenya berada permukaan eksplan. Kontaminasi permukaan dapat diatasi dengan cara :
·       Karantina tanaman induk dalam greenhouse
·       Sterilisasi kontak dengan menyikat eksplan dengan sikat halus
·       Pencucian menggunakan berbagai perlakuan bahan kimia dan durasii sterilisasi.
·       Jika permukaan tanaman ditutupi oleh rambut atau sisik, menggunakan detergen dan digoyang –goyang untuk mengilangkan gelembung udara yang mungkin mengandung mikroorganisme.
·       Penggunaan kombinasi bahan sterilan.

b.    Kontaminasi Internal
Kontaminasi yang disebabkan oleh mikroorganisme yang berasal dari eksplan yang tumbuh dan berkembang secara bertahap dalam kondisi in vitro. Pertumbuhan dan perkambangan mikroorganisme internal biasanya muncul beberapa minggu / bulan setelah di kultur. Kontaminasi internal dapat diminimalisir atau dapat diatasi dengan cara:
·      Karantina tanaman induk dalam greenhouse
·      Menggunakan HgCl2 , antibiotik dan fungisida sistemik
·      Contoh antibiotik alami yaitu propolis
·      Contoh antibiotika sintetik yaitu Plant Preservative Mixture (PPM),  Cefotaxime, Ceftriaxone, Chlorampenicol, Rifampicin, dll.
·      Penggunaan kombinasi bahan sterilan.

2.    Browning/Pencoklatan
Pencoklatan adalah suatu keadaan munculnya warna coklat atau hitam yang menyebabkan tidak terjadi pertumbuhan dan perkembangan atau bahkan menyebabkan kematian pada eksplan. Pencoklatan umumnya merupakan tanda adanya kemunduran fisiologis eksplan biasanya eksplan akan mati.

Browning terjadi akibat pengaruh akumulasi senyawa fenolik yang teroksidasi akibat stress mekanik atau pelukaan pada eksplan. Senyawa fenol tersebut adalah enzim polifenol eksidase dan tirosinase. Dalam kondisi oksidatif akibat pelukaan, enzim tersebut akan secara alami disintesis oleh tanaman sebagai bentuk pertahanan diri. Menurut Laukkanen et al. (1999) dalam Hutami (2008), ketika sel rusak, isi dari sitoplasma dan vakuola menjadi tercampur, kemudian senyawa fenol teroksidasi menghambat aktivitas enzim. Senyawa fenol yang berlebihan akan bersifat racun yang merusak jaringan eksplan dan akhirnya menyebabkan kematian eksplan (Corduk and Aki, 2011).

Menurut George dan Sherrington (1984) ada beberapa cara untuk menanggulangi masalah pencokelatan, seperti:
a.    Meminimalisir senyawa fenol
·                          -Transfer eksplan ke media baru
·                        -   Penambahan arang aktif untuk menonaktifkan enzim peroksidase.Enzim tersebut merupakan                          kelompok enzm oksidoreduktase yang berperan sebagai katalis reaksi oksidasi senyawa fenol.
·                           -  Penggunaan PVP (Polivenolpirolidon) untuk mengikat senyawa fenol agar tidak teroksidasi
·                         -   Penambahan antioksidan seperti Asam askorbat, PPVP (polivinilpolipirolidon) dan DTT (1,4-ditio-              DL-treitol) untuk  menurunkan akumulasi peroksidase
·                      -     Pencucian eksplan pada air mengalir
b.    Modifikasi Potensial Redoks
·         Penggunaan asam askorbat (C6H8O6) untuk menghambat reaksi oksidasi senyawa fenolik, karena asam askorbat memiliki potensial redoks yang rendah serta mampu mengikat oksigen
·         Perendaman eksplan dalam air pasca pemotongan dari tanaman induk mampu menekan oksidasi dari oksigen bebas.

c.    Penghambatan Aktifitas Enzim Fenol Oksidase
·         Penggunaan Ethylene Diamine Tetra Acetate (EDTA) dapat menghambat aktivitas polifenol oksidase dengan mengikat ion-ion seperti Cu++ Co++, dan Zn++, yang mempu menjadi senyawa fenol ketika teoksidasi
·         EDTA Juga dapat mengganggu aktivitas enzim peroksida.

d.   Penurunan Aktifitas Fenolase
  • Penggunaan Asam askorbat mampu menurunkan pH, karena pH optimum enzim Fenol Oksidase berkisar antara 4,0-7,0.
  •  Penggelapan selama ± 14 hari mampu menekan aktifitas fenolase. Cahaya mempengaruhi sintesa enzim pada pigmen, oksidasi fenol akan meningkat dengan adanya cahaya (Creasy, 1968 dalam Hutami, 2008).

3.    Senescence
Senescence dicirikan dengan menguningnya daun karena penurunan jumlah klorofil dan kloroplas (Gut et al., 1987 dalam Ryun Woo et al., 2001). Secara alami senescence timbul akibat dari kematian sel yang dilakukan oleh tanaman itu sendiri (Programmed Cell Death / PCD), karena pengaruh umur dan cekaman lingkungan sekitar (Yoshida, 2003).

Berkurangnya unsur hara merupakan salah satu bentuk cekaman lingkungan dari tanaman in vitro, karena pertumbuhan tanaman sangat tergantung pada media di dalam botol. Semakin lama media tersebut akan berkurang dan mengakibatkan proses metabolisme tanaman in vitro akan menjadi lambat. Menurut Schippers et al. (2007), kekurangan nitrogen dapat mempercepat senescence pada daun, tetapi peranan hormon juga menentukan prerkembangan proses senescence pada daun. Senescence dapat pula terjadi akibat berkurangnya kandungan sitokinin dalam media, karena sitokinin berperan dalam pembentukan kloroplas dan menghambat penuaan (senescence) (Wattimena, 1992; Parthier, 2004; Srivastava, 2001; Gan and Amasino, 1995). Sitokinin juga berpengaruh terhadap distribusi nutrisi menuju ke daun dari bagian-bagian tanaman yang lain (Taiz and Zeiger, 2010).

Selain itu, kondisi cekaman aerasi juga dapat menjadi penyebab senescence pada tanaman in vitro. Menurut Jackson et al. (1994); Jackson (2003), dalam kondisi in vitro mengharuskan tanaman untuk tumbuh dalam botol yang tertutup rapat, semakin lama tanaman akan kesulitan mendapatkan oksigen dan karbondioksida sementara itu etilen akan terus terakumulasi. Lebih lanjut, He et al. (1996); Wang et al. (2002); Bailey-Serres and Chang (2005); Peng et al. (2005); Drew et al. (1979) dalam Geisler-Lee et al. (2010), menyatakan bahwa dalam kondisi anoksia, akan terjadi peningkatan prekursor etilen (1-Aminocyclopropane-1-Carboxylate (ACC) Sintase (ACS) dan ACC Oksidase (ACO)) dan berakibat pada peningkatan konsentrasi etilen. Akumulasi etilen akan menghambat pertumbuhan planlet dan dapat memacu senescence pada daun (Aharoni and Lieberman, 1979; Grbic and Bleecker, 1995; Jing et al., 2002; Jing et al., 2005).

4.    Eksplan Dorman
Eksplan yang mengalami dorman terlihat tidak mampu merespon zat pengatur tumbuh tetapi dari fisik eksplan tersebut masih terlihat segar. Terjadinya dormansi pada eksplan diduga akibat senyawa fenolik yang masih tersisa dalam eksplan. Senyawa fenol tersebut keluar secara osmosis menyebar di sekitar eksplan dan mengganggu distribusi hormon dan nutrisi dari media, sehingga sel-sel tidak merespon media perlakuan. Menurut Corduk and Aki (2011); Kaewubon and Meesawat (2009), akumulasi senyawa fenol dalam media menyebabkan eksplan kehilangan kemampuan untuk tumbuh selama masa kultur. Sakakibara et al. (2004) menyatakan bahwa senyawa fenol mampu mengaktifkan enzim sitokinin oksidase (CKX) yang mampu mendegradasi sitokinin.

Dalam upaya pencegahan agar tidak mendapati eksplan yang dorman dapat dilakukan dengan menghindari bahan tanam yang tidak juvenil atau tidak meristematik., Karena awal pertumbuhan eksplan akan dimulai dari sel-sel yang muda yang aktif membelah, atau dari sel-sel tua yang muda kembali. Selain itu dapat dicegah dengan penggunaan media kultur yang cocok.

5.    Hiperhidrisitas
Hiperhidrisitas atau yang biasa disebut dengan istilah vitrivikasi merupakan gelaja pertumbuhan planlet yang tidak normal atau ketidak normalan morfologi dan fisiologis. akibat stress yang tibul karena pelukaan, tidak optimalnya media kultur maupun lingkungan mikro (wadah kultur) (Kevers et al., 2004). Lebih lanjut,  Rice et al., 1992 menyatakan bahwa kadar ammonium dan kandungan uap air yang berlebihan didalam wadah kultur juga dapat menyebabkan gejala tersebut. Hal tersebut juga berkaitan dengan kosentrasi sitokinin yang terlalu tinggi, rendahnya potensial matriks, dan meningkatnya kosentrasi etilen didalam wadah kultur (Kevers et al., 1984). Uap air akan menyebabkan media menjadi berair serta sitokinin juga mempengaruhi sel dalam menyerap air, sehingga air akan terakumulasi pada apoplast. Seperti penelitian yang dilakukan Rojes-martinez et al., 2010 bahwa hiperhidrisitas dapat terjadi akibat kondisi jenuh air dan akumulasi gas pada wadah kultur. Kondisi tersebut juga merupakan kondisi anoksia.

Hiperhidrisitas tentunya tidak diharapkan pada kultur in vitro. Tanda-tanda Hiperhidrisitas, seperti:
·      Tanaman  yang dihasilkan pendek-pendek atau kerdil, seringkali tidak mempunyai internodus atau juga memiliki internodus yang berhimpitan.
·      Pertumbuhan batang cenderung kearah pertambahan diameter
·      Daunya memiliki kecenderungan melebar pada bagian pangkal, akhirnya helaian berbentuk seperti panah.
·      Daun memiliki klorofil yang sedikit di bandingan dengan yang normal
·      Tanaman terlihat lemah dan tembus cahaya karena mengandung banyak air

6.    Variabilitas Genetik
Variabilias genetik dapat dikatakan menjadi salah satu kendala dalam kultur in vitro apabila tujuan pengkulutran tersebut untuk upaya perbanyakan tanaman yang seragam dalam jumlah yang banyak, dan bukan sebagai upaya pemuliaan. Variabilitas genetik dapat disebabkan oleh Subkultur berulang tanpa terkontrol atau juga disebabkan oleh metode kultur yang tidak sesuai.

7.    Eksplan Gosong
Istilah “Eksplan gosong” bukan berarti eksplan tersebut hangus terbakar, akan tetapi ada bagian tertentu pada eksplan dimana selnya menjadi mati, tetapi bukan akibat browning. Sering kita mendapati eksplan yang ditanam menjadi mati, atau ada bagian pada eksplan yang mati dalam beberapa hari saja. Mengidentifikasi eksplan gosong memang agak sulit karena ciri-cirinya menyerupai browning. Tetapi secara visual, eksplan gosong sama seperti daun yang direndam beberapa menit dalam air panas.

Eksplan gosong dapat terjadi akibat:
·      Konsentrasi bahan sterilan yang terlalu pekat
·      Kesahalahan pemilihan bahan sterilan
·      Durasi  sterilisasi yang terlalu lama
·      Kerusakan mekanis akibat penggoyangan yang terlalu keras
·      Media yang digunakan tidak cocok, atau kesalahan dalam membuat media
·      Peralatan dissecting set masih panas saat digunakan untuk memotong atau menanam eksplan

Agar tidak mendapati eksplan yang gosong, ada beberapa tindakan pencegahan, seperti:
·      Penggunaan bahan sterilan dan durasi sterilisasi dioptimalkan
·      Penggoyangan eksplan pada saat sterilisasi jangan terlalu kuat
·      Memastikan alat yang digunakan telah dingin pasca sterilisasi alat menggunakan lampu Bunsen. Atau setidaknya panas akibat sterilisasi tersebut dipastikan tidak melukai sel eksplan. 

Read More
Posted by Sepdian Luri on Wednesday, March 26, 2014

Dalam siklus sel, kedua hormon tersebut terlibat dalam tiap fase. Memasuki fase G1/S, sitokinin dan auksin berperan sebagai grow factor yang menginduksi protein D-type Cyclins (CYCD) dan A-type Cyclin-Dependent Protein Kinase (CDKA). Kedua protein tersebut mengawali siklus sel dan menjadi aktif karena proses fosforilasi (D’Agostino and Kieber, 1999; Riou-Khamlichi et al., 1999; Francis and Sorrell, 2000; Inze and De Veylder, 2006, Rechenmann, 2010). Pada fase ini auksin mampu mendegradasi CDK inhibitors (Kip-Related Proteins (KRP)), yang dapat menghambat aktifitas kedua protein tersebut (Himanen et al., 2002). Menurut Wang et al. (1998), Inze and De Veylder (2006), KRP dapat muncul karena ada rangsangan dari senyawa antimitogen seperti asam abisat (ABA) atau kondisi cekaman lingkungan yang menyebabkan tanaman menjadi stress. Lebih lanjut Verkest et al. (2005) menyatakan bahwa KRP secara alami dibutuhkan tanaman untuk deferensiasi sel.
Aktivasi CYCD dan CDKA menyebabkan Retino Blastoma-Related Protein (RBR) yang mengkikat protein E2FA/B and DPA (Dimerization Protein) menjadi terfosforilasi, sehingga protein tersebut dapat mengontrol ekspresi gen esensial memasuki fase sintesis (S). Pada fase tersebut, aktivitas CYCD dan CDKA menyebabkan protein E2FC dan DPB terfosforilasi. Akibatnya protein tersebut menjadi target ubiquitinasi oleh E3 ubiquitine ligase Skp1/Cullin/F-box protein (SCF) SKP2 dan akhirnya terdgradasi (del Pozo et al., 2006; Inze and De Veylder, 2006). Pada penelitian sebelumnya, del Pozo et al. (2002) melaporkan bahwa protein E2FC dan DPB yang tidak terdegradasi dapat menekan ekspresi gen pada fase S dan menghambat pembelahan sel.
Pada fase S, akumulasi auksin justru akan mendegradasi F-box protein SKP2, sehingga stabilitas protein E2FC dan DPB tetap terjaga. Hal ini akan menghambat pembelahan sel tetapi akan meningkatkan ukuran sel (del Pozo et al., 2002). Protein tersebut aktif pada sel yang terdiferensiasi (Jurado et al., 2008). Peristiwa ini terkait dengan aktivitas faktor transkripsi AUX/IAA (Tan et al., 2007; Han et al., 2009).
Memasuki Fase G2/M, melibatkan Cyclins (CYCs) dan Cyclin-Dependent Protein Kinase (CDKs) yang lebih komplek. Pada fase ini CDKs terfosforilasi oleh aktivitas enzim Tyrosine Kinase WEE1 untuk menghambat CYCs/CDKs masuk ke fase mitosis (M) (Inze and De Veylder, 2006). Enzim Tyrosine Kinase WEE1 dibutuhkan dalam fase G2/M untuk mengontrol CYCs/CDKs masuk ke fase M sebelum replikasi DNA selesai dilakukan, karena dalam fase ini terjadi perbaikan-perbaikan DNA jika mengalami kerusakan (De Schutter et al., 2007). Untuk memasuki fase M, sitokinin berperan mengaktivasi enzim phosphatase CDC25 untuk mendefosforilasi CDKs dari Tyrosine, sehingga CYCs/CDKs dapat kembali aktif melanjutkan ke fase M (Zhang et al., 2005).

Setelah terbentuk sel-sel baru, ada sebagian sel yang terdiferensiasi. Terkait dengan proses pemanjangan batang, perkembangan sel-sel tersebut diawali dengan peningkatan ukuran sel. Hal tersebut dapat juga disebabkan karena endoreduplikasi, yaitu penggandaan kromosom tanpa terjadinya sitokinesis. Ishida et al. (2010) menyatakan bahwa endoreduplikasi mengarahkan perkembangan sel tanaman dari proliferasi menuju deferensiasi, dan auksin berperan mengatur proses tersebut. Terkait dengan siklus sel, protein E2FC dan DPB dapat menghambat pembelahan sel, dan auksin berperan dalam menjaga stabilitas protein tersebut, sehingga siklus sel tidak melalui tahapan mitosis (del Pozo et al., 2002). 

Read More
Posted by Sepdian Luri on Sunday, March 23, 2014

Secara umum menurut Davies (2004); Srivastava (2001) peranan sitokinin adalah memacu pembelahan sel pada kalus, morfogenesis, pertumbuhan tunas lateral, perluasan permukaan daun yang dihasilkan dari pembelahan sel, mengawali perkembangan kloroplas. Sedangkan menurut Salisbury and Ross (1995), sitokinin juga mampu menunda penuaan tanaman.

a.    Pembelahan sel
Pada siklus sel, sitokinin berperan dalam mengatur pembelahan sel khususnya pada fase G2 dari mitosis. Hal tersebut sesuai dengan hasil penelitian yang dilakukan John et al. (1993) menyatakan bahwa sel tembakau segar yang diisolasi tanpa sitokinin mampu melintasi fase S tetapi tidak mampu berkembang ke tahap mitosis. Sitokinin berperan dalam aktifasi enzim phosphatase Cdc25 untuk mereduksi phospat. Keberadaan phospat akan menghambat enzim intraseluler cyclin-dependent protein kinase (CDK). Enzim CDK berperan dalam melepaskan transkripsi gen pada tahap replikasi DNA (Zhang et al., 2005).
Dalam aplikasinya, sitokinin sering digunakan bersama dengan auksin untuk berberapa tujuan, seperti pada sebuah penelitian mengenai mitosis dan pembelahan sel di jaringan tembakau yang dukulturkan, Das et al. (1985) dalam Fox (1989) memperlihatkan bahwa dengan penambahan IAA dapat terjadi sedikit mitosis di dalam jaringan, terutama di dalam sel-sel binukleat, ketika ditambahkan kinetin yang dikombinasikan dengan IAA ternyata mampu menginduksi banyak mitosis yang kemudian diikuti sitokinesis. Hal yang sama dikemukakan oleh Guttman (1956) dalam Fox (1989), bahwa kinetin terkadang bekerja selama proses antarfase mitosis dalam sel-sel akar bawang (Alium cepa) untuk memacu profase selanjutnya. Penelitian yang lain menyebutkan bahwa, sitokinin berpengaruh terhadap pembelahan sel-sel dewasa di dalam korteks akar yang memacu penggandaan kromosom pada tanaman kacang polong (Pisum sativum cv. Alaska) (Torrey, 1961 dalam Fox, 1989).

b.    Pembesaran sel
Selain memacu pembelahan sel, sitokinin juga memacu pembesaran sel. Pembesaran sel disebabkan oleh serapan H2O dalam sel karena sitokinin mampu membuat membrane sel menjadi permeable (Liu et al., 1997; Rose and Rayle, 1982; Thomas et al., 1981). Selain itu menurut Rayle et al. (1982) kemampuan peningkatan  sitokinesis lebih kecil dibandingkan dengan penyerapan H2O oleh sitokinin.
Hal tersebut secara hampir bersamaan dikemukakan oleh tiga kelompok peneliti, bahwa pembesaran sel pada jaringan diskus daun kacang buncis yang layu meningkat luar biasa dengan terdapatnya kinetin (Miller, 1956; Kuraishi and Okumura, 1956; Scoot da Liverman, 1956 dalam Fox, 1989). Sejak penelitian ini, bukti peranan sitokinin dalam pembesaran sel makin bertambah, Arora et al., (1959) dalam Fox (1989) melaporkan bahwa sel-sel kortikal dari akar tembakau membesar sampai ukuran empat kali ukuran normal dengan terdapatnya kinetin.

c.    Pembentukan kloroplas
Kloroplas merupakan salah satu bentuk diferensiasi dari proplastid yang terkena cahaya. Menurut Nakano et al. (2001) ketika jaringan mesofil terkena cahaya, proplastid berkembang menjadi kloroplas dengan seluruh rangkaian fungsional fotosistem untuk fotosintesis, akan tetapi ketika ditempatkan pada tempat yang gelap menjadi etioplast. Proses diferensiasi sel tersebut tak lepas dari pengaruh aktifitas enzim yang mengatur ekspresi gen kloroplas. Menurut Okazaki et al. (2010), kloroplas tidak dapat membentuk dengan sendirinya, akan tetapi dikontrol oleh protein PVD (Plastid Division) yang mengkode gen inti. Protein tersebut dikontrol dengan adanya sitokinin yang menentukan banyak tidaknya protein yang terbentuk. Menurut Yaronskaya et al. (2006) juga menyatakan bahwa sitokinin mengatur biogenesis dan fungsi dari kloroplas yang mengatur ultrasturktur dari kloroplas, kegiatan enzim kloroplas, akumulasi pigmen dan laju fotosintesis. Zubo et al. (2008), melaporkan bahwa sitokinin (Benzyl adenine)  memacu aktifitas transkripsi gen kloroplas yang terlihat dari akumulasi mRNAs kloroplas dari daun barley muda berumur 9 hari.

d.    Pembentukan dan Perkembangan Tunas
Pembentukan tunas disebabkan karena sitokinin memberikan sinyal ke sitokinin reseptor untuk ekspresi gen komplek IPT (Adenosine phosphate - Isopentenyl Transferase) (Howel et al., 2003). Gen tersebut berperan dalam pembentukan sitokinin dan mengatur biosintesis (Miyawaki et al., 2004). Distribusi dari bioaktif sitokinin sangat menentukan perkembangan meristem untuk pembentukan tunas (Kurakawa et al., 2007).
Pembentukan tunas lateral juga ditentukan oleh adanya sitokinin dalam media in vitro. Tanaka et al. (2006) menyatakan bahwa gen IPT terekspresi pada mata tunas yang berada pada batang setelah tunas apikal dipotong. Menurut Geroge et al. (2008), penggunaan sitokinin dengan konsentras tinggi cenderung meningkatkan jumlah tunas akan tetapi tunas tersebut berukuran pendek. Turnbull et al. (1997) dalam percobaan dengan memotong tunas apikal tanaman buncis. Ternyata dalam kurun waktu 6 jam kadar sitokinin dalam tunas ketiak meningkat 7 kalilipat dan diiringi dengan pemanjangan tunas aksilar yang terdapat pada ketiak daun. Menurut Hopkins and Huner (2004), akumulasi sitokinin dalam ketiak daun berasal dari akar sebagai organ penghasil sitokinin, kemudian di translokasikan ke seluruh bagian tanaman khususnya pada jaringan meristem melalui xilem.

Peranan sitokinin banyak dikaitkan dengan adanya auksin yang berperan sinergis terhadap perkembangan sel untuk morfogenesis (George et al., 2008). Hal tersebut dibuktikan dengan hasil-hasil penelitian yang membuktikan adanya peranan dari kedua zat pengatur tumbuh ini terhadap pertumbuhan. Weier et al. (1974) dalam Abidin (1990) mengemukakan bahwa dalam perbandingan sitokinin lebih besar dibandingkan dengan auksin, akan memperlihatkan stimulasi pertumbuhan tunas dan daun, sebaliknya apabila sitokinin lebih rendah dari auksin, akan mengakibatkan stimulasi pada pertumbuhan akar. Sedangkan apabila perbandingan sitokinin dan auksin berimbang, maka pertumbuhan tunas, daun dan akar akan berimbang pula. Tetapi bila konsentrasi sitokinin sedang dan konsentrasi auksin lebih rendah maka akan membentuk kalus.

Gambar Konsentrasi relatif penggunaan sitokinin dan auksin untuk morfogenesis


Read More
Posted by Sepdian Luri on


Sitokinin pertama kali ditemukan oleh F. Skoog and C. Miller (1950) sebagai pemacu pembelahan sitokinesis. Sitokinin yang pertama kali di temukan adalah adenine yang merupakan bentuk dasar dari kinetin (6-furfuryl amino pourine) Schmulling (2004). Senyawa tersebut dapat meningkatkan pembelahan sel, pembesaran sel, poliferasi pucuk, dan morfogenesis pucuk (Smith, 1992 dalam Zulkarnain, 2009). Menurut George dan Sherrington (1984), apabila ketersediaan sitokinin di dalam media kultur in vitro sangat terbatas, maka pembelahan sel pada jaringan yang dikulturkan akan terhambat. Bila jaringan tersebut dikulturkan pada medium dengan kandungan sitokinin yang memadai maka pembelahan sel akan berlangsung secara singkron. Selain kinetin, zeatin (6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino) purine) merupakan salah satu sitokinin alami yang ditemukan pada jagung muda (Miller, 1965; Martin et al., 2001). Ada juga beberapa sitokinin sintetis yang sering digunakan dalam kultur in vitro seperti, benzyl adenine (BA), 6-benzyl amino purine (BAP), 2-iP, Thidiazuron (TDZ).


Struktur sitokinin alami, a). Kinetin; b). Zeatin
Sitokinin telah ditemukan pada sebagian besar tumbuhan tingkat tinggi, khususnya pada daerah meristematis akar, daun muda, buah yang sedang berkembang, dan biji (Salisbury and Ross (1992); Srivastava (2001), akan tetapi produksi utama sitokinin terdapat pada ujung akar (George et al.,2008).

Secara singkat biosintesis sitokinin pada tumbuhan tingkat tinggi melalui jalur mevalonate (MVA Pathway) diawali isomer Isopentyl pyrophosphate + adenosine monophosphate (AMP) dirubah menjadi Isopentyl adenosine 5 fosfat (Isopentenyl AMP) kemudian dihidrolisis oleh enzim  isopentenyl AMP synthase menjadi fosfat dan isopentenyl adenosine. Isopentenyl adenosine kemudian melepaskan gugus ribose dan membentuk isopentenyl adenine (sitokinin), mengalami oksidasi menjadi zeatin (siokinin) dan mengalami reduksi NADPH menjadi dihidrozeatin (sitokinin) (Mc Gaw, 1995).

Transport sitokinin melalui dua cara yaitu sistem transport antar sel dan sistem transport jarak jauh. Pada percobaan menggunakan tanaman Arabidopsis, terjadinya translokasi sitokinin antar sel karena adanya katalisator berupa protein sel purin permease (PUP) dan equilibrative nucleoside transporter (ENT) yang membawa sitokinin melewati membran sel (Kudo et al., 2010; Cedzich et al., 2008).

 Sistem transport jarak jauh sitokinin bersifat akropetal dan basipetal. Sitokinin yang diproduksi di akar di translokasikan melalui xylem pada jalur transpirasi menuju pucuk-pucuk tunas atau daun. Bentuk sitokinin utama yang di transport melalui xilem berupa zeatin rebosida (tZR). Sedangkan translokasi melewati floem bersifat basipetal berupa isopentenyl adenine (iP) dan isopentenyl adenine ribosida (iPR) (Kudo et al., 2010; Hirose et al., 2008).

Read More
Posted by Sepdian Luri on Friday, March 21, 2014

Kerangka Teori

Tanaman tebu (Saccharum officinarum L.) adalah salah satu anggota dari genus Saccharum dan famili tanaman rumput-rumputan (Graminae) yang merupakan tanaman asli tropika basah (Wrigley, 1981). Tanaman ini menjadi  bahan baku utama dalam pembuatan gula. Hingga saat ini, gula merupakan salah satu komoditas strategis dalam perekonomian Indonesia karena disamping sebagai salah satu kebutuhan pokok masyarakat juga sebagai sumber kalori yang relatif murah (Goenardi et al., 2007). Namun berdasarkan hasil Survei Sosial Ekonomi Nasional (SUSENAS) oleh Badan Pusat Statistik, produksi gula nasional pada tahun 2010 sampai dengan tahun 2012 diproyeksikan akan terus meningkat rata-rata sebesar 2,96% per tahun, namun produksi gula dalam negeri diperkirakan baru mampu memenuhi tingkat konsumsi gula rumah tangga, tetapi belum mampu memenuhi kebutuhan industri (Respati et al., 2010). Oleh sebab itu, pengembangan tanaman tebu perlu untuk dilaksanakan secara intensif, salah satunya adalah dengan pengembangan bibit yang berkualitas.
Perbanyakan mikro atau mikro propagasi secara in vitro merupakan alternatif dalam pengadaan bibit yang berkualitas. Menurut Pierik (1987); Gunawan (1992); George et al. (2008); Iliev et al. (2010), beberapa kelebihan dari penggunaan teknik kultur in vitro dibandingkan dengan cara konvensional yaitu: faktor perbanyakan tinggi, tidak tergantung pada musim karena lingkungan in vitro terkendali, bahan tanaman yang digunakan sedikit sehingga tidak merusak pohon induk, tanaman yang dihasilkan bebas dari penyakit meskipun dari induk yang mengandung pathogen internal, tidak membutuhkan tempat yang sangat luas untuk menghasilkan tanaman dalam jumlah banyak.
Perbanyakan mikro yang dilakukan secara in vitro dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa teknik kultur, salah satunya adalah dengan teknik kultur kalus. Kultur kalus merupakan salah satu teknik dalam kultur in vitro. Kalus merupakan sekumpulan sel amorphous yang terjadi dari jaringan atau sel sel yang terdediferensiasi dan tidak terorganisir yang secara terus menerus akan membelah diri karena pengaruh hormon dan zat pengatur tumbuh (Pierik, 1987). Menurut Heartmann and Ketser (1983); Dodds and Roberts (1995), kalus dapat muncul karena ada jaringan yang mengalami pelukaan, dan biasanya munculnya kalus karena adanya interaksi zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin. Secara umum kalus dapat muncul karena adanya infeksi dari agrobakterium tumifaciens atau akibat jaringan yang mengalami stress (George and Sherrington, 1984)
Prinsip dari kultur kalus adalah mendediferensiasi suatu jaringan agar sel-selnya dapat beregenerasi kembali untuk beberapa tujuan, seperti perbanyakan dan kloning  tanaman melalui pembentukan organ dan embrio, regenerasi varian-varian genetika, mendapatkan tanaman bebas virus, sebagai sumber produksi protoplas, sebagai bahan awal untuk kreopreservasi, produksi metabolit sekunder dan biotransformasi (Zulkarnain, 2009).
Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain (Halperin, 1969; George and Sherrington, 1984; Pierik, 1987). Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa akar, batang, daun, bunga (Pierik, 1987). Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet.
Dalam perkembangannya, bentuk kalus dapat dibedakan berdasarkan tekstur dan sifat fisik. Berdasarkan tekstur, kalus dibedakan menjadi kalus kompak dan remah atau friable. Kalus kompak yaitu kalus yang terbentuk dari sekumpulan sel yang kuat dan keras yang terbentuk dari proses lignifikasi sel. Sedangkan kalus remah terdiri dari sel- sel lepas menjadi fragmen-fregmen kecil. Kalus kompak mempunyai kandungan polisakarida pada dinding sel yang tinggi, presentase selulosa rendah dibanding dengan pektin dan meiselulosa. Kandungan selulosa yang tinggi dapat meningkatkan sel lebih rigrid dan dapat menahan fragmentasi (Aitchison et al., 1977).
Berdasarkan perubahan ukuran sel, metabolisme dan penampakan kalus tersebut, proses perubahan eksplan menjadi kalus dapat dibagi menjadi tiga tahap yaitu, induksi, pembelahan dan diferensiasi. Pada tahap induksi, sel siap membelah, metabolisme menjadi aktif dan ukuran sel tetap konstan. Tahap pembelahan, sel aktif membelah atau bersifat meristematis  terjadi penurunan ukuran sel. Pada tahap diferensiasi, ditandai dengan pembesaran sel, pembentukan vakuola dan penurunan laju pembelahan (Aitchison et al., 1977).
Pertumbuhan kalus terdiri dari lima fase yang dapat digambarkan dalam bentuk kurva sigmoid yaitu 1). Fase lag, sel siap untuk membelah; 2). Fase pertumbuhan eksponensial, pembelahan sel yang terjadi secara maksimal; 3). Fase pertumbuhan linear, terjadi penurunan kapasitas dalam pembelahan sel dan pembesaran sel; 4). Fase penurunan kecepatan tumbuh; 5). Fase stasioner atau periode tidak ada pertumbuhan, jumlah sel konstan. (Phillips and Hubstenberger, 1995).
            Banyak peneliti melaporkan bahwa zat pengatur tumbuh yang efektif digunakan untuk menginduksi kalus tanaman tebu adalah 2.4-D (Gandonou et al., 2005; Ali et al., 2008). Selanjutnya Jalaja et al. (2008) menyatakan bahwa 2.4-D dengan konsentrasi 1-6 mg.l-1 efektif dalam menginduksi pembentukan kalus tanaman tebu. Rashid et al. (2009) berhasil mendapatkan sejumlah kalus tanaman tebu yang optimal dengan formulasi media MS + 2.4-D 2 mg.l-1. Sukmadjaja dan Mulyana (2011) dalam penelitiannya, juga menggunakan media MS + 2 mg.l-1 2,4-D + 0,4 mg.l-1 BAP + 2000 mg.l-1 Casein Hidrolisat (CH) untuk menginduksi kalus.

Read More
Posted by Sepdian Luri on Wednesday, March 19, 2014



Secara umum, prinsip dasar kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. Menurut Yusnita (2004), kultur jaringan didefinisikan sebagai usaha mengisolasi, menumbuhkan, memperbanyak dan meregenerasikan protoplas (bagian hidup dari sel), atau bagian tanaman seperti meristem, tunas, daun muda, batang muda, ujung akar, kepala sari, dan bakal buah dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman tersebut dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap.
Teknik kultur jaringan merupakan alternatif perbanyakan tanaman jabon yang sangat efektif menghasilkan bibit berkualitas dalam jumlah banyak dengan waktu relatif singkat. Keuntungan menggunakan teknik kultur jaringan diantaranya adalah untuk memperbanyak tanaman tertentu yang sulit atau lambat diperbanyak secara konvensional, memerlukan waktu yang singkat untuk mendapatkan bibit yang banyak, tidak memerlukan tempat yang luas, dapat dilakukan sepanjang tahun tanpa tergantung musim, bibit yang dihasilkan lebih sehat dan memungkinkan dilakukannya manipulasi genetik (Yusnita, 2004).  Secara umum, ada beberapa kendala yang sering dihadapi dalam kultur jaringan tanaman berkayu, yaitu : a). Keberhasilan teknik ini pada jenis tanaman tersebut masih rendah sehingga aplikasinya masih terbatas pada jenis tanaman tertentu saja, b). Kapasitas regenerasi menurun bila sering dilakukan pembaharuan, c). Penurunan integritas genetik pada bibit yang dihasilkan, d). Persentase keberhasilan aklimatisasi pada tanaman tahunan berkayu relatif masih rendah, dan e). Adanya patogen internal yang sulit dihilangkan (Hendaryono dan Wijayani, 1994).











Metode kultur yang sering diterapkan dalam kultur jaringan jabon adalah kultur pucuk menggunakan tunas yang mengandung meristem pucuk (apikal dan lateral). Menurut George et al. (2008), teknik kultur dengan menggunakan tunas aksilar paling banyak digunakan karena metode ini paling efektif dan memiliki keberhasilan tinggi untuk perbanyakan tanaman. Metode ini juga merupakan metode yang paling banyak diterapkan untuk produksi masal tanaman kayu (Lineberger, 1980). Tujuan dari kultur pucuk adalah perangsangan dan perbanyakan tunas-tunas atau cabang-cabang aksilar. Proses penggandaan tunas sangat tergantung pada konsentrasi zat pengatur tumbuh sitokinin pada media kultur (Iliev et al., 2010). Tunas-tunas yang berhasil tumbuh dapat di subkultur atau diperbanyak lagi atau dapat diakarkan dan ditumbuhkan dalam kondisi in vivo.
Penelitian kultur jaringan untuk tanaman jabon belum banyak dipublikasi, akan tetapi ada beberapa peniliti yang telah melakukan kultur jaringan tanaman jabon. Apurva dan Thakur (2009) yang telah berhasil membentuk embrio somatik dan induksi akar dari kalus jabon dengan menggunakan media MS + KIN (23.2 μM) + NAA (2.7 μM) dan air kelapa (15%), selain itu Kavita et al. (2009) juga telah melakukan induksi tunas menggunakan eksplan tunas apikal dan nodul dari pohon jabon dan melaporkan bahwa dengan penggunaan MS+ BAP dengan konsentrasi tinggi (2,5; 5,0 dan 10 mg/l) terjadi peningkatan jumlah tunas per eksplan, akan tetapi pemanjangannya terhambat. Maharia dan Setiawan (2010), juga telah melakukan induksi tunas jabon dengan manggunakan media MS+ BAP 1 mg/l.

Read More
Posted by Sepdian Luri on Monday, February 11, 2013


Tujuan dari kultur pucuk adalah perangsangan dan perbanyakan tunas-tunas atau cabang-cabang aksilar. Proses penggandaan tunas sangat tergantung pada konsentrasi zat pengatur tumbuh sitokinin pada media kultur (Iliev et al., 2010). Tunas-tunas yang berhasil tumbuh dapat di subkultur atau diperbanyak lagi atau dapat diakarkan dan ditumbuhkan dalam kondisi in vivo.
Metode kultur yang sering diterapkan adalah kultur pucuk menggunakan tunas yang mengandung meristem pucuk lateral pada ruas ke-2. Anis et al., 2003 telah mengujikan tunas aksilar dan apikal dari tanaman Morus alba, dan hasilnya menunjukkan bahwa tunas aksilar menghasilkan tunas lebih banyak dan lebih responsif dibandingkan dengan tunas apikal. Ukuran pucuk yang digunakan kurang lebih 2 cm. Menurut Wattimena et al., 1992, ukuran eksplan yang lebih besar memiliki tingkat pertumbuhan lebih cepat pada tahap inisiasi secara in vitro. Selain itu menurut George et al. (2008), teknik kultur dengan menggunakan tunas aksilar paling banyak digunakan karena metode ini paling efektif dan memiliki keberhasilan tinggi untuk perbanyakan tanaman. Metode ini juga merupakan metode yang paling banyak diterapkan untuk produksi masal tanaman kayu (Lineberger, 1980). Selain itu dengan kultur pucuk memungkinkan untuk mengontrol tunas yang bebas virus dan laju perbanyakannya tinggi.

Read More
Posted by Sepdian Luri on Sunday, February 10, 2013

About The Author

Visitors

Followers

Pagerank

Popular Posts