Kultur Jaringan Tanaman

Di setiap laboratorium dimana teknik kultur jaringan digunakan harus mempunyai sejumlah fasilitas yang mencakup al.:

- Ruang pencucian

- Ruang persiapan media, sterilisasi dan penyimpanan

- Ruang transfer aseptik

- Ruang kultur atau inkubator yang lingkungannya terkontrol

- Ruang pengamatan dan koleksi data Diagram laboratorium kultur jaringan dapat dilihat pada gambar B-2.1.

Ruang pencucian harus mempunyai bak cuci, meja kerja yang terbuat dari bahan yang tahan terhadap asam dan basa, rak pengering dan mempunyai saluran untuk air demineralisasi atau destilasi, ruang untuk tempat oven pengering, alat/mesin pencuci dan pengering, serta rak atau lemari penyimpanan alat.

Di dalam ruang persiapan media harus tersedia tempat untuk penyimpanan bahan-bahan kimia, gelas kultur dan penutupnya, dan peralatan gelas yang diperlukan untuk pembuatan media. Meja yang kokoh atau ”bench” untuk penyimpanan ”hot plate magnetic stirrer”, pH meter, timbangan, dan dispenser harus tersedia. Peralatan lain yang biasanya ada di ruang persiapan dan pembuatan media antara lain alat vaccum, distiling unit, bunsen, refrigerator (kulkas) dan freezer untuk penyimpanan larutan stok dan bahan kimia, mikrowave, kompor gas, oven dan autoclave untuk sterilisasi mdia, peralatan gelas dan peralatan lain. Didalam pembuatan media kultur, bahan-bahan kimia yang digunakan harus yang bertaraf analitik dan penimbangannya harus baik dan benar. Agar lebih akurat, dalam pembuatan media harus dilakukan tahap demi tahap dan bahan-bahan yang digunakan harus di ”checklist”. Air yang digunakan dalam pembuatan media harus berkualitas tinggi yang mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi. Air ledeng atau sumur tidak digunakan untuk pembuatan media karena mengandung kation-kation (amonium, kalsium, besi, magnesium natrium, dll.), anion-anion (bikarbonat, klorida, flourida, fosfat, dll.), mikroorganisme (algae, jamur, bakteri), gas-gas (oksigen, CO2, nitrogen) dan bahan-bahan lain (minyak, bahan organik dll.). Air yang digunakan dalam kultur jaringan harus mempunyai standar type II (minimum) yaitu bebas pirogen, gas, dan bahan organik dan mempunyai konduktivitas elektrik kurang dari 1.0 µmho/cm. gambar Metoda yang paling umum untuk pemurnian air standar type II adalah dengan deionosasi yang diikuti dengan satu atau dua destilasi gelas. Deionisasi menghilangkan dari bahan yang bersifat ionik dan proses destilasi menghilangkan molekul-molekul organik, mikroorganisme dan pirogen. Metode-metode lain yang dapat digunakan untuk mendapatkan air murni type II adalah

(1) penyaringan dengan cara absorpsi, dengan menggunakan karbon aktif untuk menghilangkan kontaminan organik dan bebas klorine;

(2) penyaringan dengan membran, yang menghilangkan bahan-bahan partikulat dan kontaminasi oleh bakteri; dan

(3) reverse osmosis, yang menghilangkan sekitar 99% bakteri, bahan organik dan bahan partikulat.

Teknik kultur jaringan dapat berlangsung dengan sukses apabila dilakukan dibawah kondisi laboratorium yang sangat bersih. Oleh karena itu pemindahan atau transfer biakan dikerjakan dalam ruang transfer steril atau laminar air flow. Laminar air flow yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman adalah tipe horizontal dan dirancang dengan mempunyai ruangan yang bebas dari partikel debu yang halus dan dilengkapi dengan sinar ultra violet (UV) serta unit penyaring udara. Penyaring udara harus mempunyai filter udara dengan efisiensi tinggi atau ”high-efficiency particulate air (HEPA filter). HEPA filter harus mempunyai pori sekitar 0.3 µm dengan efisiensi kerja berkisar 99.97 – 99.99%. Semua permukaan ruang kerja dalam laminar harus dirancang dan mempunyai konstruksi sedemikian rupa sehingga debu dan mikroorganisme tidak dapat berakumulasi dan permukaan tempat kerja dapat mudah dibersihkan dan diidisinfeksi.

Semua jenis kultur harus disimpan dalam tempat yang terkontrol baik temperatur, sirkulasi udara, kelmbaban maupun kualitas dan lamanya cahaya. Faktor-faktor lingkungan tersebut akan mempengaruhi proses pertumbuhan dan diferensiasi biakan baik secara langsung maupun tidak langsung. Kultur protoplas, suspensi sel dan kultur anther adalah yang paling sensitif terhadap kondisi lingkungan. Suhu ruang kultur untuk pertumbuhan umumnya berkisar antara 15o – 30oC, dengan fluktuasi kurang dari ±0.5oC; akan tetapi kisaran suhu yang lebih besar mungkin diperlukan untuk tujuan percobaan. Ruang kultur harus mempunyai pencahayaan hingga 10.000 lux. Suhu dan cahaya harus dapat diprogram selama 24 jam. Ventilasi udara harus baik dengan kelembaban berkisar 20-98%.

Peralatan yang diperlukan dari suatu laboratorium umumnya adalah sbb.:

1. Hot plate/magnetic stirrer atau kompor

2. Peralatan gelas (gelas ukur, erlenmeyer) atau stainless steel untuk memanaskan dan melarutkan media

3. Alat sterilisasi dengan tekanan uap (autoclave)

4. pH meter

5. Timbangan (analitical dan bench top loading)

6. Gelas ukur gradual

7. Botol kultur dengan penutupnya

8. Dispenser

9. Alat diseksi (spatula, scalpel (pinset), forcep, gunting)

10. Refrigerator

11. Distiling unit atau water deionizer

12. Oven

13. Microwave

14. Mikroskop

15. Pipet ukur

16. Shaker

17. Laminar air flow

18. Disinfectant

19. Bahan kimia yang diperlukan untuk pembuatan media (Lampiran)

20. Dll.

Peralatan gelas yang digunakan di lab kultur jaringan umumnya terbuat dari Pyrex. Erlenmeyer dari berbagai ukuran (50, 125, 250, 500, 1000 atau 2000 ml) digunakan untuk wadah kultur dan pembuatan media. Tabung gelas, cawan petri, botol jam atau bekas selai juga sering digunakan sebagai botol kultur. Peralatan gelas tesebut harus tahan panas selama proses sterilisasi dengan oven atau autoclave. Peralatan gelas lain yang biasanya digunakan adalah gelas piala, gelas ukur, pipet dan labu ukur.

Umumnya penggunaan operasional di lab perbanyakan tanaman dengan kultur jaringan dapat dipelajari dengan mudah. Hal yang paling perlu diperhatikan adalah akurasi, kebersihan dan keamanan saat bekerja dengan teknik kultur jaringan. Penimbangan Pada saat pembuatan media, semua bahan yang ditimbang harus dilakukan dengan hati-hati meskipun untuk pembuatan media dalam skala komersial. Setiap penggunaan timbangan atau alat-alat lain harus memperhatikan instruksi dari pabrikannya.

Jenis timbangan yang sering digunakan di lab antara lain top-loading balance dan analytical balance yang memungkinkan akurasi penimbangan hingga skala milligram. Beberapa persyaratan yang harus diperhatikan agar diperoleh penimbangan yang akurat adalah (i) timbangan harus ditempatkan pada tempat yang keras, stabil, permukaannya rata yang bebas getaran dan kebocoran, (ii) daerah sekitar penimbangan harus terjaga kebersihannya, (iii) yang terpenting lagi, penimbangan jangan sampai pernah overload, (iv) penimbangan disarankan menggunakan wadah atau alas yang ringan atau kertas daripada menempatkan bahan yang ditimbang secara langsung di atas piring timbangan.

Pengukuran cairan/larutan Peralatan gelas yang mempunyai ukuran seperti gelas piala, erlenmeyer dan pipet diperlukan untuk pembuatan media. Gelas ukur kapasitas 10, 25, 100 dan 1000 ml banyak digunakan untuk mengukur volume, tetapi pengukuran yang lebih akurat diperlukan labu ukur dan pipet. Pengukuran larutan dengan menggunakan pipet dan labu ukur hanya akan akurat apabila bagian dasar dari cekungan antara air dan udara berada tepat pada tanda pengukuran. Penggunaan pipet harus dibantu dengan alat penghisap larutan (pipetor). Jangan pernah menggunakan mulut untuk memipet. Jenis-jenis pipetor yang umum digunakan antara lain (i) tipe bola penghisap yang dilengkapi dengan beberapa katup pengontrol, (ii) pipet penghisap yang dioperasikan menggunakan roda kecil pada bagian atas alat penghisap, (iii) alat penghisap dengan bantuan pompa udara secara elektrik. Cairan dihisap kedalam pipet dengan menekan tombol bagian atas dan melepaskan cairan dengan menekan tombol bagian bawah, (iv) pipet mikro, biasanya untuk pengambilan larutan dengan volume yang sangat kecil (mikro liter).

Membersihkan peralatan gelas Metoda konvensional pencucian peralatan gelas dilakukan dengan merendam gelas dalam larutan asam kromat yang diikuti pembilasan dengan air kran dan air destilasi. Karena asam kromat dapat menyebabkan korosif, maka cara ini banyak ditinggalkan kecuali untuk peralatan gelas yang terkontaminasi tinggi. Pencucian yang lebih aman adalah dengan air panas (>70oC) + sabun, diikuti dengan pembilasan dengan air panas dan air destilasi. Peralatan gelas yang telah dicuci, dikeringkan dalam oven pada suhu 150oC dibungkus dengan aluminium foil, kemudian disimpan dalam lemari tertutup.

Sterilisasi Bagian yang sangat penting dalam teknik in vitro adalah sterilisasi bahan tanaman dan media dan menjaga kondisi aseptik yang telah dicapai. Bakteri dan jamur adalah dua kontaminan yang paling banyak dijumpai dalam kultur. Spora jamur sangat ringan dan ada disekeliling lingkungan. Apabila spora jamur kontak dengan media kultur dan kondisinya optimal untuk perkecambahan jamur, maka akan terjadi kontaminasi.

a. Sterilisasi Ruang Kultur dan Transfer

Sterilisasi ruang kultur yang paling baik adalah dilakukan dengan penggunaan sinar ultraviolet (UV). Waktu sterilisasi bervariasi tergantung dari ukuran ruang transfer itu sendiri dan harus dilakukan apabila tidak ada kegiatan dalam ruang tersebut. Radiasi UV sangat berbahaya bagi mata dan kulit. Ruang transfer dapat juga disterilisasi dengan mencuci/mengepel 1-2 kali setiap bulan dengan bahan anti jamur (fungisida) komersial. Ruang kerja dalam laminar flow biasanya sudah dilengkapi dengan lampu UV, sehingga sterilisasinya dilakukan dengan UV dan diikuti dengan membasuh/melap permukaan tempat bekerja dalam laminar dengan alkohol 95% sebelum mulai bekerja. Ruang kultur harus dibersihkan dengan sabun kemudian dilap dengan Na-hypoklorit 2% (merek komersial seperti Sunclin, Bayclin atau pembersih lantai lain yang mengandung disinfektan) atau alkohol 95%. Lantai ruangan dan dinding harus dibesihkan seminggu sekali dengan bahan yang sama.

Peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu 130o-170oC selama 2-4 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada suhu 170oC. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave tidak dsarankan untuk bahan yang erbuat dari metal karena akan menyebabkan karat. Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau laminar, setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol 96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen. Teknik ini disebut sterilisasi pembakaran (flame sterilization). Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-hati karena alkohol sangat mudah terbakar. Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap air. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung, saringan dari nylon, pakaian lab, tutup plastik, peralatan gelas, pipet, air, dan media kultur. Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit.

Ada dua metoda untuk sterilisasi media yang umum digunakan, yaitu dengan autoclave dan filter membran. Media kultur, air destilasi dan campuran yang stabil dapat disterilisasi dalam autoclave dengan menggunakan wadah yang ditutup dengan kapas, aluminium foil atau plastik. Akan tetapi, larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil (heat-labile) harus menggunakan filter. Umumnya media diautoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu 121oC. Untuk volume larutan per wadah yang sedikit (< 100 ml), waktu yang dibutuhkan adalah 15-20 menit, tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit. Tekanan jangan melebhi dari 20 psi karena dapat mengakibatkan dekomposisi karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat thermolabile.

Beberapa senyawa yang tergolong dalam kelompok protein, vitamin, asam amino, ekstrak tanama, hormon dan karbohidrat ada yang bersifat thermolabile yang mungkin akan mengakibatkan dekomposisi bila disterilisasi dengan autoclave, sehingga harus disterilisasi dengan filter. Filter Millipore yang mempunyai porositas ± 0.2 mikron (µm) merupakan salah satu filter yang banyak digunakan untuk sterilisasi bahan yang bersifat thermolabile. Peralatan gelas yang akan menampung media yang disterilisasi dengan filter harus sudah disterilisasi dahulu dengan autoclave.

Media yang sebagian mengandung komponen thermolabile, dapat dibuat dengan cara: (i) larutan yang mengandung komponen heat-stable disterilisasi dengan autoclave, kemudian didinginkan sampai suhu 50o-60oC pada kondisi steril (biasanya dalam laminar), (ii) pada bagian lain dalam kondisi yang steril, larutan yang mengandung komponen besifat thermolabile disterilisasi dengan filter, (iii) kedua larutan yang sudah disterilisasi dengan metoda yang berbeda tersebut digabungkan dalam kondisi aseptik. d

Mendapatkan bahan tanaman yang steril merupakan hal yang sulit. Meskipun bermacam tindakan pencegahan sudah dilakukan, 95% kultur akan mengalami kontaminasi apabila eksplan tidak didisinfeksi. Organ atau jaringan tanaman harus disterilisasi dengan larutan disinfektan, karena sebagai bahan biologis tidak dapat dilakukan dengan cara pemanasan yang ekstrim.

Tidak ada metoda yang baku untuk sterilisasi eksplan, sehingga waktu perendaman dalam larutan disinfektan merupakan kisaran karena tergantung pada jenis bahan dan tanaman yang akan disterilisasi. Larutan yang digunakan harus yang aman bagi jaringan/eksplan tetapi bersifat dapat membunuh kontaminan baik bakteri maupun jamur. Untuk tanaman berkayu, umbi dll. biasanya sebelum disterilisasi dengan larutan disinfektan harus dibersihkan dahulu dengan sabun dan dibilas dengan air mengalir, tetapi tidak untuk tanaman jenis herbaceous. Semua permukaan eksplan yang disteriliasi harus terendam dalam sterilan, dan setelahnya harus dibilas dengan akuades steril sekurang-kurangnya tiga kali.

Menentukan pH larutan pH larutan diukur berdasarkan konsentrasi ion hidrogen dalam larutan. Skala pH mulai dari 0 (sangat asam) hingga 14 (sangat basa) dan skala 7 adalah titik netral. pH dari media kultur umumnya diatur 5.7 ± 0.1 sebelum diautoclave. pH dapat memengaruhi kelarutan ion-ion di dalam media, kemampuan agar untuk menjadi gel dan selanjutnya mempengaruhi pertumbuhan sel-sel. Oleh karena itu akurasi pH media menjadi faktor yang penting untk diperhatikan. Umumnya pengukuran pH media menggunakan pH meter.